Filminhalt: Larry (Ben Stiller) ist geschieden und seinen Sohn sieht er nur so ein bis zwei Mal pro Woche. Beruflich sieht es bei ihm auch nicht rosig aus, denn er verliert oder kündigt einen Job nach dem anderen und hofft darauf, seine fragwürdigen Erfindungen irgendwann endlich zur Marktreife zu bringen. Doch eines Tages setzt ihm seine Exfrau Erica (Kim Raver) die Pistole auf die Brust und stellt ihn vor die Wahl: Entweder er findet einen festen Job oder er darf seinen Sohn Nick (Jake Cherry) nicht mehr sehen. Da er ihn aber über alles liebt, nimmt Larry widerwillig einen Nachtwächterjob im nationalen Naturkundemuseum an. Schon bei seiner ersten Schicht lassen ihn die alten Nachtwächter die Aufgabe alleine erledigen. Doch der scheinbar simple Job stellt sich als sehr kompliziert heraus, denn im wahrsten Sinne des Wortes wird in der Nacht im Museum die Geschichte lebendig: Alle Figuren und ausgestopften Tiere beginnen nachts zu leben und Larry hat alle Hände voll zu tun, die Meute zu bändigen...